黄精多糖的提取工艺及其纯化分离

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作者:admin    来源:未知    发布时间:2019-09-23 18:35    浏览量:

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  黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手

  本论义次要是对黄精多糖的提取工艺遴行参数盼优化,并对摄取的黄糖多糖进行纯他、分手,其研究缩果如下; 程度,进行难交尝试,对提取工艺参数进行丁优化筛选,确斑了黄耩多糖热水浸提法的最佳王艺条伟;温度为80"C,谲液比为1:15,提取时蠲为4h,p珏值为7, 提取次数1次. 3)黄精多糖的纯化;蛋自蕨的去除;透过魄较三氯乙酸法、Scrag法、酶法-I-Sevag法静去除蛋 白质结果,褥出最镶的去除骚自质方式为:酶法+Sevag法。 色素的去除;通过比力分歧粉末状活饿炭的插手量及分歧沸腾时间对脱色 结果媳影响,褥出;粉末状瀵性炭翅量必lS蛭,沸腾畦阗必ISmin即可达至《理 想的脱色结果。 真空冷冻干燥,即可精制得纯度为85.16%的黄精多糖。4)黄稽多糖静分手: 通过比力DE-32、DE-52、DEAE-SephadexA--50对黄耩多糖的分手结果, 得醯j;用DEAE—SephadexA--50对黄精多糖的进行分手,结果较为抱负,W将 黄糕多糖分为PSPl、PSP2、PSP3篡个维分。 5)黄精多糖的理化性质阐发 逶过度子量测定,PSPI、醛&、PSP3携分子鬣努裂势23.2莠、26万、27.8 黄精多精的提取工艺及其纯化、分手通过薄层色谱(11£)和气相色谱(GIC)阐发,褥出PSPI、PSP2、PSP3均由 6:25.4:1构成。环节词:黄精;多糖;提取_I艺;优化;藏交尝试;纯化;分手;理化性质 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手Abstract Themain job ofthis eassy optimizetheextraction process PolygonatumsibiricumRed polysaccharides andto purify andisolatethe Polygonammsibiricum Red polysaccharides.The砧飘dts ofresearchareshownasthe following: 1)Theoptimization extracttingprocess Polygonatumsibiricum Red polysaccharides withwanNtwaterdiffusion: Through orthogonalexperimentfindthatthebestconditionsfor processof extracttingpolysaccharides from Polygonatum sibiricumRedis 80"Csample:water= 1:15,4hours,pH7。one time. 2)Theexaminationontheconcentrationratio ofleachingliquor andneededalcohol quantity:. Intheprocessofethanol precipitating,throughexamining polysaccharidessedimentedinthedifferentconcentrationratioof leachingHquorand neededalcohol quantityfind thatthebestconcentrationratioof leachingliquor neededalcoholquantily is1/6timeand6times. 3)ThepurificationofPolygonatum sibiricumRed polysaccharides: Throughcomparing trichloroaceticacidmethod,Sevag methodandthe combinationof enzymic methodand SevagmethodSmd thatthebest way toremove protein from Polygonatum sibiricumRed polysaccharides is:thecombinationof enzymicmethodand Sevag method. Inthe process removingpigment,comparingtheeffectof quantity ofactive carbon power boilingtimeto removingpigmentfind that:whenthe dosage activecarbonpowel is15%andthe boiling timeis15rain,theeffectof removing pigmentilthebesL ThroughromvingWOmin。pigment andsmallmolecularsubstance,thepurity PolygonatumsibkicumRed polysaccharides canbereached85.16%. 41Theisolationof Polygonatum sibiricumRed polysaceharidcs: Comparing theeffect ofparatingPolygonatum sibiricumRed polysaccharides withDE-32。DE-52and DEAE-SephadexA--50findthat usingDEAE-Sephadex 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手50 topamtePolygonatum sibiricumRed polysaccharides thebestway PolygonatumsibiricmRed polysaccharidesc瓶bepamted PSPl、PSP2、PSP3. 5)Analyzing physico-chemical property Polygonatmnsibiricum Red polysaccharides: Having determinedmoleculm"massfound.matthemolecularmassofPSPlPSP2 andPSP3is2.32X105。2.60xt05and2.78:<10s. Through analysisofTLCandGC。fredthat Polygonatum mbjricumRed polysaccharides arecomposedbyglucosetmannoseand galactose-uronic acidand moleratioof g]UCO,mannoseandgalactose—uronic acidis6:25A:1。 Keywords:Polygonamm sibiricum Red;polysaccharides;extracttingprocess; optimize;orthogonslexperiment;purify;separate;physico-chemicalproperty 1.1多糖的研究概况多糖是由二十多个单糖到上万个单糖通过糖苷键毗连成的一类主要的大分 子物质。按来历分歧,多糖可分为五大类:真菌多糖、高档动物多糖、藻类地衣 多糖、动物多糖、细菌类多糖[唐小江等,1998],此中以高档动物和真菌中含 量最为丰硕。多糖作为一种主要的生物体内的大分子,与核酸和卵白质一样与生 物体的机能亲近相关。过去认为糖类在生物体内的感化次要是作为能源物质,例 如动物体内的糖原和动物中的淀粉;或者是作为布局物质,如动物中的纤维素等. 至上世纪中叶,越来越多的研究表白,糖连系物在消息传送和分子识别过程中起 着环节的感化。跟着人们发觉多糖对恶性肿瘤、炎症和心血管疾病都有必然的疗 效而且具有抗衰老感化,以及多糖研究手段的提高,国表里对多糖的研究都有空 前的成长[Franz0,1989]。 现实上国外对天然药物多糖的研究曾经有上百年的汗青了,内容包罗中草药来历多糖无效成分的提取、分手、纯化、布局测定、布局革新、糖链合成、使用 医治以及布局.功能关系研究等等。制备和筛选了一系列天然产品多糖,除用于 研发新型药物和保健食物,还作为粘接剂、不变剂,化妆品等普遍使用于工业上 [周建华,1991]。 自t930年德国人发觉了真菌多糖的抗癌结果,出格是1969年日本千原报道 了香菇多糖的抗肿瘤活性以来[张艺等,1997],多糖的研究便全面展开,对象 包罗真菌、地衣、动动物,范畴涉及多糖的化学研究、药学研究、医治使用等, 特别是真菌多糖的抗肿瘤研究成为一个热点.此中,一些分子量几千以上,具有 很强生物活性的多糖的研究遭到日益注重,它们的心理活性、化学布局以及构效 关系成为多糖研究的前沿阵地,取得了很大的进展[hbetyAet矗l,1993][Boarae Yet al,1993]。日本十分注重对多糖的研究。80年代以来,已无数种多糖使用 于临床【Radem缸h既TNet吐t9881,如香菇多糖(Lentinan)、裂褶多糖 (Schizophyllan)、云芝多糖(PS。K)及猪苓多糖(757)等。近年来,日本学者 在常规化学方式的根本上,大量引进现代分子生物学手艺与手段,加强了中药多 糖活性决定簇等的化学布局与功能关系的研究,并在柴胡、当归等中药的研究方 面有了必然的冲破。美、欧亦十分注重糖类的研究【王克夷,1993]。1989年日本 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 创刊了‘糖科学与糖工程动态》杂志。91年实施“糖工程媒介打算”。美国能源 部1986年建立了复合糖类研究核心,成立复合糖类数据库,到1996年曾经收集 了42000个糖布局数据【陈惠黎,2000]。欧盟1984.1998年启动“欧洲糖类研究开 发收集”打算,旨在照顾欧洲列国的糖类研究。现已确证糖类作为消息分子在受 精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统衡态的维持等方面的主要感化。炎 症和本身免疫疾病、老化、癌细胞的非常增值和转换、病原体传染、动物和病原 体彼此感化、动物与根瘤菌共生等心理和病理过程都有糖类的介导【张树政, 1999】。 国内对多糖的研究起步较晚,但有丰硕的中草药资本和雄厚的保守西医理 论,进展甚快【王一飞等,1996][张翼伸等,1979]。70年代以来,我国在云芝糖 肽、银耳多糖、刺五加多糖、交联淀粉、苦豆子胶、田菁胶、竹黄多糖和黄芪多 糖的研究中呈现出可喜的前景【常兆生,1985]。近20年来,还别离从灵芝、黑木 猴头菌、竹荪,茯苓、地黄、金针菇、魔芋、山药、汉防己、芦荟等平分离获得具有显著心理活性的多糖均一体。目前,我国对药用多糖的研究仍多侧重于提取、 分手、精制、化学构成和免疫药理等方面,虽然大部门多糖品种尚处于尝试阶段, 可是也有几种多糖在生物药范畴有了长足的前进,如香菇多糖、黄芪多糖、人参 多糖的打针针剂已作为二类新药面市。但新型的糖生物学及工程学还没有获得应 有的注重,和国外比拟仍有必然的差距. 1.2多糖的生物活性 1.2.1加强免疫感化【张倩等,1998] 已证明分歧的多糖具有分歧的免疫推进感化。【张倩等,1998]香菇多糖是理 想的免疫推进剂,它作为T细胞定位的佐剂和辅助T细胞刺激参与机体免疫反 应,现己发觉,其具有高度特同性免疫加强感化。在带癌形态下一方面它能活性 腹腔巨噬细胞的杀伤抗原能力,另一方面它能恢复已降低的免疫功能,出格是能 恢复T_协助细胞的活性,同时近百倍的提高抗胸腺依赖性抗原的体液性抗体【杨 本文译,1984][汪春风,19961。灵芝[G血odermIncidam(Leyssexfr)tarsq子实体多糖 能加强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力,诱导细胞色素P-450的构成,有益于加强 机体的防御功能,提高机体连结稳态的能力【沈萍萍等。19911。银耳多糖能推进淋 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手巴细胞的转化,加强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能,较着推进肝脏卵白质核酸的 合成以及推进骨髓造血功能,提高体液免疫力【沈萍萍等,1991]。黑木耳多糖可有 效的提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数和百分率【江萍,1997】。同样从猪苓 (PolyprusUmbellatus)菌核中获得的一种水溶性多糖能显著提高小鼠腹腔巨噬细 胞的吞噬活力,推进抗体构成,是一种优良的免疫调理剂【谢九皋等,19971。汉防 己_(SetphaniateterandraS.moore)多糖,免疫药理尝试表白,具有能刺激小鼠淋巴细 胞的增生和血清不提的合成,但匹敌体的发生无推进感化【董群等,1995]。免疫功 能尝试表白:软枣猕猴桃多糖对小鼠免疫功能有推进感化,并对免疫抑止小鼠的 免疫功能也有调理感化【石铖等,1992】。药理尝试表白,茶多糖具有加强免疫功能, 推进单核巨噬细胞系统吞噬功能【汪春风,1996】。研究表白:莼菜杂多糖是一种免 疫推进机,能较着推进巨噬细胞的吞噬能力,使免疫器官脾脏分量添加,其他多 糖如薏仁米、大蒜、刺梨、萝卜等提取的多糖对T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬 细胞别离具有分歧的加强感化,可加强机体细胞免疫功能【江萍。1997]。 1.2.2降血糖,降血脂感化【王常青等,1995] 材料表白【吴寿金等,1992],从银耳、猴头、黑木耳和灵芝等真菌中提取的 多糖,从海带、紫菜、茶叶、甘蔗、稻根、米糠等食物中提取的多糖,以及从中 草药中提取的黄芪多糖、麻黄多糖、紫草多糖、薏苡仁多糖、人参多糖、知母多 糖、山药多糖和乌头多糖等80余种多糖可使四氧嘧啶诱发的高血糖尝试动物的 血糖浓度较着下降。过去视为无养分价值的果胶、纤维素海藻胶等目前已被证明 具有必然的降糖感化,持久食用它们,(1).可使动物的胰腺增大,胰卵白酶和a一 淀粉酶活性升高,胆汁生成量和排出量添加【祝向红等,1993]:C2).可使肝脏中 与糖代谢相关的酶活性上升,肝细胞上胰岛素受体数目增加,对胰岛素亲和力增 高;(3).可耽误胃的排空时间。恰是因为这些食物多糖的降糖多远,以及防止 肠肛病变和降脂,而被养分学家称为“炊事纤维”或“第七养分素” 大都研究认为【吴杰,19931,可溶性好的和有凝胶特征的多糖,如琼脂、果胶、 海藻胶、阿拉伯树胶和从魔芋中提取的葡甘聚糖【马甘平,1993]等多种粘液质均 能起到降低血浆与肝组织胆固醇含量和调理脂卵白代谢的感化,而不溶性多糖, 如纤维素、木质索等降脂结果较差[AndersonJW1985]。 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 1.2.3抗病毒感化【左绍远20051[蒋毅等,199711陈学军,1999] 研究表白,很多分歧来历的多糖具有抗病毒活性。如抗艾滋病毒(卸[、,)、 抗乙肝病毒、抗轮状病毒感化、抗疱疹病毒等。王月五【王月五,200H等研究甘草 多糖(oPS)对牛艾滋病毒(BIV)、腺病毒I型(AdVLII)和柯萨奇病毒(CBV3) 的抑止感化,成果发觉,GPS对BIV有必然的抑止感化,抑止率伟36.2%,GPS 对AdVIII和CBV3也有较着的抑止与间接灭活感化。李丹【李丹,2004]等报道, 香菇多糖能推进传染HIV的人PBMC细胞排泄IL.-2、IL-12、IFN.n抑止 I14、IL-10、TNF-a的排泄,传染HIV组表示更为较着,而且表示出浓度依 赖关系。表白香菇多糖推进传染f未传染H【、r的PBMC排泄I类细胞因子,抑止 排泄II类细胞因子。还有研究表白香菇多糖对改善慢性肝炎患者的症状,体征及 降低ALl'、GFr的疗效好、且不变,而且有必然的抑止乙型肝炎病毒复制的作 用。据报道,用香菇多糖打针医治慢性肝炎108例,用量为2ml(含香菇多糖 4rag)ira,gd。8周为一疗程,医治后HBs.Ag阴转率为9%,HBeAg阴转率为55 %、降ALT无效率为88%[杨金龙等。1993]。廖植荣【廖植荣,1992]用香菇多糖治 疗106例慢性乙肝,3mo后成果GPT复常率占91.5%。在已发觉的抗病毒多糖 中,活性较强的是硫酸化多糖.如牛漆多糖有免疫加强感化而无抗病毒活性,但 在牛漆多糖中引入部门硫酸基团后,就具有较强的抗乙肝病毒HBsAg与HBeAg 的活性【方唯硕。1993]。香菇多糖引入硫酸基团后,能抑止HIV发生的细胞病变。 从红藻平分离出的硫酸半乳糖在体外能抑止HIV-1,HIV-2惹起的细胞病变,同 时也抑止合胞体的构成,还具有抑止其它病毒的感化【WirvrouwM,1994]。别的, 灰树花多糖、裂隙菌多糖、灵芝多糖等也有抗HIV的感化【张高红20041.邵传 森(绍传森等,1991]等报道了中华猕猴桃多糖体外抗轮状病毒感化。中华猕猴桃多 糖是从猕猴桃根部以水醇法提取的多糖复合物,是一种新的免疫调理剂,在体内 外能庇护组织细胞免疫流感病毒和疱疹病毒传染。尝试时对细胞先传染轮状病毒 后插手猕猴桃多糖,发觉其对轮状病毒有抑止感化。所以认为猕猴桃多糖可望成 为一种无效的抗轮状病毒药物。李凡【李凡等。1998]等采用从酵母泥中提取的酵母 多糖对13中RNA及DNA病毒在分歧细胞长进行抗病毒感化研究及机理切磋。 成果表白,酵母多糖具有较着的抗脊髓灰质炎病毒I型,埃可病毒6型,柯萨奇 病毒A16,B3,新型肠道病毒7I型,水泡性口炎病毒,腺病毒m型,纯真疱疹 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 病毒I,型的活性。表示为能显著抑止细胞病变的发生,使组织培育的细胞得 到庇护. 1.2.4抗肿瘤感化【左绍远,2005】 多糖类作为抗肿瘤药物的最大长处是毒副感化小,能与化疗药物有协同效 应,并能抵当化疗药物对骨髓的抑止能毒副感化。绝大大都多糖类的抗肿瘤感化 次要是通过调理机体的免疫功能而实现的,一般认为在抗肿瘤免疫医治中,细胞 免疫起到更主要的感化。香菇多糖能加强肿瘤患者NK细胞、细胞毒T细胞 (CTL)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)及单核巨噬细胞的活性,并可诱导INF-3、 自细胞介素(也)等细胞因子的发生,因而香菇多糖具有较好的抗肿瘤感化,已 在临床获得较普遍的使用【刘明,2003]。董志恒等【董志恒20041报道也.2合用银 耳多糖可无效地提到LAK细胞活性,加强银耳多糖抗肝癌细胞的感化。谢遵江 等【谢遵江,20031也发觉,人参多糖与IL-2结合体内使用对肿瘤细胞有极强的杀 伤与抑止感化,并认为其机制可能是人参多糖诱导发生的细胞因子能加强IL-2 对T细胞、NK细胞与肿瘤淋巴浸湿细胞的功能。曲显俊【曲显俊,20001能发觉, 螺旋藻多糖(PSP)在体外能较着抑止B37乳癌细胞和硒62自血病细胞,体内 研究表白,PSP能抑止H22肝癌细胞、ECA肿瘤细胞及S180癌细胞等。其抑止 肿瘤的机制与PSP能全面调理机体免疫功能亲近相关【左绍远1996】。作为一种较 有使用前景的广谱抗肿瘤药物,PSI'已逐渐起头用于临床医治【陈新美,20041。陈 群等【陈群。2003|报道,银杏叶多糖(GBLP)对S180实体瘤及¥180腹水瘤都有 较着的抑止感化,且有剂量效应关系。许爱华等【许爱华2004]发觉。银杏外种皮 多糖在体外对HL-60细胞的增殖有较着的抑止感化,其机制与银杏外种皮多糖 诱导HL-60细胞凋亡并抑止抗凋亡基因bcl一2的表达相关.目前银杏外种皮多糖 已起头进行临床抗肿瘤试验研究【陈华圣,2003】。王树英等【王树英,2004]报道树舌 多糖能显著抑止小鼠HepA肝癌细胞,其机制为树舌多糖能加强抗癌基因lib与 P16的表达,并诱生INF-a。刘瑞等【刘瑞,20041也发觉云芝子实体多糖(CVE) 能抑止HepA肝癌细胞,其机制与CVE的免疫调理、抑止肿瘤转移亲近相关。 陈留勇等【陈留勇,20041报道黄桃果肉多糖(HTP)对小鼠Lewis肿瘤诱较着的抑 制感化,其抑瘤感化与HTP断根自在基、调理机体免疫功能相关。赵国华等【赵 国华。2003]报道,山药多糖150mg/Kg对Lewis肺癌与B16黑色素瘤有最佳抑止 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手感化。李小定等【李小定,20021发觉,灰树花多糖对S180肉瘤有显著的掷制感化, 并认为灰树花多糖既可杀死肿瘤细胞,又可提高机体免疫能力.此外,己发觉枸 杞多糖、云芝多糖、红毛刺五加多糖、猪苓多糖、甘草多糖等均具有抗肿瘤活性。 1.2.5雷同肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素的感化 自光假孢杆菌(Pseudrnonasfluoresecens)菌体提得的一种复合多糖.促皮质糖 (n’G),具有雷同皮质激素和促皮质激素的感化。可能是间接感化于下丘脑,促 使垂体释放促皮质激素和改善肾上腺皮质功能。临床上用于急慢性风湿性关节 炎。别的,自巴拿马门氏(Salmonellapanama)菌体提得的沙门氏多糖体(Salgin) 也有雷同肾上腺皮质激素和促肾上腺皮质激素的感化。 1.2.6抗溃疡感化 N公司研制的一种抗溃疡寡糖类药NEso,能间接与幽门螺旋菌连系,阻 止其与胃肠受体相感化【李晓玉等,1994]。由白芨葡萄糖甘露聚糖构成的白芨胶被 日服后,在胃肠道中能敏捷与胃肠受体感化构成胶浆,在胃肠粘膜及其溃疡面上 构成庇护膜,阻遏胃酸、胃卵白酶等与其接触,敏捷推进溃疡面的愈合。上海天 平制药厂研制的胃舒宁次要成分就含白芨胶,临床上用于胃肠溃疡、轻度肠胃出 血,疗效显著。 1.2.7抗凝血感化 肝素可抑止凝卵白酶原转化为凝血酶,有抗凝血感化。从褐藻掌状昆布 (Laminariadlgitata)提取的昆布多糖对豚鼠血液的研究证明,该多糖的硫酸化 衍生物有肝素样感化.由14.聚.B_D.甘露糖醛和k古罗糖酸构成的藻酸,硫酸 化后也具有抗凝血感化。海带多糖除抗肿瘤感化外,在体表里均有抗凝血感化, 抗凝活性为7肝素u/rag[扬彬。1992]。 1.2.8抗辐射及阻抗放射性元素和毒素的接收 动物多糖是中药放射防护剂的次要无效成分。枸杞多糖能提高丫射线映照小 鼠免疫功能,亦降低造血细胞对射线的敏感性;南沙参多糖,可提高丫射线年,Skoryna报道藻酸钠能显著降低sr在鼠消化道的吸 收,无效削减其在骨骼中累积,含L古罗糖醛酸量越大,其阻吸感化越大.此 外,食物中的纤维素能阻抗人体对食物添加剂、农药、合成洗涤剂等无害物质的 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 接收f张松等,1996]。 1.2.9其他感化 香菇多糖[FulmshlK,19901可显著防止老年糖尿病和白内障惹起的视网膜病 的并发症发生。红芪多糖【陶文若等,1993]能显著降低心肌收缩力,减慢窦型心 率的感化,并进一步导致兔左心室压降低,心输出量削减,该感化是间接感化于 心肌,降低心肌耗氧量,庇护缺氧心肌。 1.3多糖的提取、纯化、分手与化学成分研究 1.3.1多糖的提取 起首要按照多糖的具有形式及提取部位分歧决定在提取之前能否作预处 理,对于动物多糖一般采用丙酮、、乙醇进行预处置,目标是脱脂.对于植 物多糖常采用机械破坏的方式粉碎细胞壁。预处置后的残渣常用水作溶剂来提取 多糖[ShidaM,etal19751。温度节制在90~100"C,搅拌4~6小时,频频提取2~ 3次;此外可用碱性水溶液、氯化钠水溶液、稀酸作提取溶剂[ShidaM。酏aL.1975], 为了避免在碱处置时可能发生的一些糖苷键的断裂,碱提常通以氮气或插手硼氢 化钾(或钠)【SugiuraM。etal,1980】,硼氢化物可使糖残基还原为糖醇,因此能成功 地阻遏进一步降解,酸提时间宜短,温度不宜太高;也有用水、3%的碱溶液、 10%的碱溶液顺次提取,若为酸液或碱液提取的,提取后应当即中和。用卵白酶 消化,也是常用的从组织中释放出多糖的方式之一。凡是选用专注性低的卵白酶, 以进行普遍的卵白质水解。常用的有胰卵白酶、糜卵白酶、木瓜卵白酶、链酶蛋 白酶等。所得的多糖提取液有的可间接过滤,或者用离心法除去不溶物。归并的 多糖提取液经浓缩后,插手2~5倍的初级醇沉淀多糖;也可插手费林溶液或硫 酸铵等,使与多糖物质连系生成不溶性络合物或盐类沉淀。然后顺次用乙醇、丙 酮、洗涤后干燥,若沉淀的多糖为胶状或具有粘着性时可间接冷冻干燥。干 燥后得粉末状粗多糖。 1.3.2多糖的纯化 1.3.2.1除卵白 醇或者无机溶剂沉淀获得的多糖凡是含有较多的卵白质需要去除。除卵白的 方式凡是有盐析法、Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法+Sevag法 ll 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 1.3…211盐析法沉淀卵白最常用的方式是插手无机盐如硫酸铵或磷酸钾,在大体积的粗制 剂中插手的是干盐,若是pH值对提取物有影响则需要对溶硷等。一种更为暖和 的脱水方式是逐滴插手其pH曾经事后调理好的饱和硫酸铵溶液,在沉淀曾经纯 化或部门纯化的小体积溶液这是常用的方式。硫酸铵插手量也要留意考虑。2s~c 时硫酸铵饱和液为4.Imol/L的硫酸铵(即767克硫酸铵/升)o为3.9mol/L。 硫酸铵沉淀卵白质的过程是硫酸铵篡夺了与卵白彼此感化水分子使卵白质的溶 解性降低而沉淀下来【马淑淘等,19931[沈渤江等,1990][阎家麒等,1994]。 1.3.2.1.2 Sevag法【方历年,1984j 按照卵白质在氯仿等无机溶剂中变性的特点,用氯仿:戊醇(正丁醇)5:1 或4:1,夹杂物猛烈振摇20到30分钟,卵白质与氯仿一戊醇(正丁醇)生成 凝胶物而分手,离心,可分去水层和溶剂层交壤处的变性卵白质。此种方式在避 免降解上有较好的结果,但效率不高,凡是要频频操作9~lO次才把卵白质根基 上去除。 1.3.2.1.3三氟三氯乙烷法【张翼伸,1983】 按多糖溶液:三氟三氯乙烷1:1插手,在低温下搅拌10分钟摆布,离心得 上层水层,水层继续用上述方式处置几回,即得无蛋自质得多糖溶液。此法效率 高,但溶剂沸点较低,易挥发,不宜大量使用。 1.3.2.1.4三氯乙酸法 在多糖水溶液种滴加3%-_--氯乙酸,直至溶液不再继续混浊为止,在5~10"C 放置过液,离心除去沉淀即得无卵白质的多糖溶液。此法会惹起某些多糖的降解. 1.3.2.1-5酶法+Sevag法 在多糖水溶液中插手必然浓度的卵白酶溶液适量,于3TC保温数小时后, 按1:1的体积比插手Sevag液(氯仿:异戊醇或正丁醇=4:1),频频振荡,静 置24小时.分去沉淀部门,保留水相,采用sevag法脱卵白4次,即可除去多 糖中的卵白质。 1.3.2.2除色素【盛家荣等,1999] 对于动物来历的多糖,可能含有酚型化合物而颜色较深,这类色素大多呈负 性离子,不克不及用活性炭吸附脱色,可用弱碱性树脂DEAF_纤维素或DuoliteA_7 12 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 来吸附色素;弱糖与色素是连系的,易被DEAE纤维素吸附,不克不及被水洗脱, 这类色素可进行氧化脱色:以浓氨水(或NaOH)调至PH8.0摆布,50以下, 滴加Hz02至浅黄色,保温2小时;发酵来历的多糖颜色一般较浅;对于动物, 微生物等提取获得的多糖也可按照不怜悯况按上述方式处置。一般环境下,尽量 避免用活性炭处置,因活性炭会吸附多糖,形成多糖丧失。 1.3.2.3除小分子杂质水提醇沉法获得的多糖凡是含有低聚糖、盐类等的一些小分子杂质需要去 除,除去这类小分子杂质的常用方式是透析法,把去除卵白质而且脱色后的多糖 溶液装入必然规格的透析袋里,两端扎紧,放入去离子水中。因为透析袋是半透 性的,答应小小分子无机盐等通过,但不答应大分子通过,故可通过多次静止透 析或必然时问的流水透析达到去除小分子杂质的目标。 1.3.3多糖的分手 1.3.3.1分部沉淀法 按照分歧多糖在分歧浓度的初级醇、酮等无机溶剂中具有分歧消融度的性 质,由小而大按比例插手这些醇、酮(如甲醇、乙醇和丙酮等)可分部沉淀多糖。 Sugiura等采用此法将核盘菌多糖分为0~5%乙醇及5~20%乙醇中沉淀出来的 两部门。此法适宜于分手各类消融度相差较大的多糖。用乙醇沉淀是一种从溶液 中定量收受接管多糖的简单方式,因为分歧性质或分歧分子量的多糖沉淀所需乙醇浓 度分歧,它同样也能够用于样品中分歧多糖组分的分级分手。 影响乙醇沉淀的 要素次要有:1)多糖的浓度:一般使多糖的浓度为I%~2%摆布。浓渡过低, 需要乙醇的量就大。浓渡过高,沉淀趋势于糖浆状而难以操作。别的,在过高的 多糖浓度下,分级分手难以完全:2)盐浓度:为了使多糖完全沉淀,需要有足 够浓度的盐,即应有足够的离子强度。当一种无盐或少盐的多糖水溶液与乙醇混 应时,溶液可连结完全澄清而无沉淀生成。盐的最终浓度在5%即足够,而在大 规模制备时,盐的浓度还可小些。常用的盐有氯化钠和醋酸盐(如醋酸钠、醋酸 钾、醋酸铵)。醋酸盐的长处是:与其他盐对比,它在乙醇中有高的消融度,再 利用过量乙醇时,也不至于沉淀,而氯化物则有沉淀的可能;3) 乙醇的浓度: 若是多糖的浓度恰当,且有足够的盐具有,则4~5倍的乙醇能够使组织中的多 糖完全沉淀。可是,从卵白水解液沉淀粘多糖,乙醇用量以不跨越2倍体积为宜, 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 可避免非所需的消化产品一并沉淀.对于曾经纯化的多糖,可按照需要确定乙醇 的浓度,以达到分级分手的目标。使用2倍摆布体积乙醇频频处置,可使粘多糖 完全脱盐,即大量的含水乙醇带走了相当多的盐。用乙醇进行分级分手是分手多 糖夹杂物的典范方式,而且目前仍然用于大规模分手。例如,用1.5倍乙醇沉淀 软骨消化液可得几乎纯的硫酸软骨素,而硫酸角质素和别的一些硫酸软骨素则保 留于乙醇上清液中。在肝素纯化过程中,用42%的乙醇浓度可沉淀获得平均分 子量为11000的抗凝活性肝素。每次加乙醇时,其浓度的递增环境取决于要分手 的夹杂物的性质。但应留意,若是增加小于5%,则不会发生较着的分级结果, 所以一般采用大幅度提高浓度的法子。典型的例子是从猪皮获得的硫酸软骨素 A、c和硫酸皮肤素:在乙醇浓度为18~25%时,沉淀物为硫酸皮肤素;乙醇浓 度为30~40%HL沉淀物为硫酸软骨素A;而乙醇浓度为40~50%时,沉淀物为 硫酸软骨素c;硫酸角质素于乙醇浓度达50%以上时才沉淀。虽然乙醇分级分 离为一种很有用的方式,但也有其错误谬误,即对一组差别较小的多种成分分级分手 不克不及达到完全【M.Dubois.K.A.Cilles.J.K.Gamilton.P.A.Rebers,1956]。 1.3.3.2盐析法 分歧多糖在分歧盐浓度中消融度分歧。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫 酸铵等,以硫酸铵最佳。此法现实上是分部沉淀的一种。 1.3.3.3季胺盐沉淀法 按照季胺盐能与酸性多糖构成不溶性化合物的特征,以分手酸性多糖。常用 的季胺盐是十六烷基三甲基铵的溴化物(cAlm)及其碱(CTA-OH)和十六烷基吡啶 (CPC)。一般地说,酸性强或分子量大的多糖起首沉淀出来,所以节制季胺盐的 浓度,能分手各类分歧的酸性多糖。按照构成的沉淀能溶于分歧的盐、酸溶液和 无机溶剂中的性质,将多糖游离出来。Takeda等从地衣中提取抗肿瘤多糖就是 采用这种方式。 1.3.3.4金属络合物法 多糖能与铜、钡、钙、铅离子构成络合物而沉淀。常用的络合剂有斐林试剂、 氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。获得的络合物沉淀用5%(v/v)无机酸乙醇液或 硫化氢分化。Meier曾用分歧浓度(O.03-0.2M)的氢氧化钡沉淀B-(1一铷D一甘露聚 糖及半乳聚糖。 1.3.3.s纤维索离子互换柱层析法 14 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 常用的互换剂为DEAE-纤维素、ECTEOLA-纤维素和羧甲基纤维素。此法 适合于分手各类酸性、中性多糖及粘多糖。在pH=6时,酸性多糖能吸附于互换 剂上,中性多糖不吸附。然后用分歧离子强度的缓冲剂按酸性强弱将各类多糖依 次洗脱。洗脱体例能够是阶梯式或梯度式。若pH为碱性,中性多糖也能吸附。 中性多糖还能与硼砂构成络合物,着将柱处置成硼砂型后,改变硼砂液浓度,也 能将分歧中性多糖洗脱下来.别的,杂质还能吸附于柱上端而达到部门纯化。多 糖在柱上的吸附力与其布局相关.吸附力一般随分子中酸性基团的添加而增大。 对于线性分子,分子量大的比小的易吸附,直链多糖比分枝多糖易吸附。 1.33.6凝胶柱层析 按照多糖分子大小和外形分歧而达到分手目标.常用的凝胶有葡聚糖凝胶 (Sephadcx、Sephacryl)及琼脂糖凝胶(Sepharose).也有人用DEAE-Sephadex分手 多糖。层层剂为各类浓度的盐溶液或缓冲液,但离子浓度最好不低于0.02M.凝 胶柱层析是多糖分手的一种常用方式,最好一次装柱,均衡时流速要慢且不变。 此法也可取代透析除杂,但不适宜粘多糖的分手。 13.3.7制备性区域电泳 分歧的多糖在电场的感化下按其分子大小、外形及所负电荷的分歧而达到分 离。NorthcoteDH是如许操作的;将玻璃粉拌成浆状装柱,电泳缓冲液均衡3天, 加糖样于柱上端,接通电源,上端接正极(因电渗之故,多糖的电泳总的标的目的向 负极)。电压强度约为1.2.2V/锄,时间5一12小时.电泳完毕,将载体推出柱外, 朋分后别离洗脱。此法分手结果好,但只适宜于尝试室小规模使用。 1.33.8跨越滤 分歧的跨越滤膜排阻分歧分子量和外形的多糖通过,因此达到分手。使用 Milliporo公司出产的Pellicon跨越滤系统将柴胡多糖分为分子量分歧的四级分I、 II、m、。 1.3.3.9亲和层析 如涂有聚芬芳化合物的载体对分手某些多糖很有价值。陈广西等[Fukushi K,1990]按照多糖与抗血清能发生选择性沉淀的特征,用伴刀豆卵白(ConA)与 Sepharose4B作载体分手纯化了甘露岩藻半乳聚糖,就是按照ConA与D.甘露吡 喃糖残基具有特殊亲和力而设想出来的。 13.3.10制备性高压液相色谱(HPLC)【HancookWetal,1984] 15 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 HPLC是在典范柱层析道理的根本上,采用分布窄、粒径细的颗粒作载体, 将流动相以高压注入柱内,样品组分敏捷而又不竭地在流动相和固定相之间进行 频频多次均衡分派,相互分手,并向下迁徙,迁徙速度依赖于各组分与固定相之 间的相对亲和力。 1.3.4多糖的纯度判定 多糖的纯度尺度不克不及用凡是化合物的纯度尺度来权衡,由于即便是多糖纯 品,其微观布局也是不均一的。它的纯度只代表类似链长的平均分派。我们凡是 所说的多糖纯品本色是必然分子量范畴的均一组分。多糖纯度判定常用的方式主 要有超离心法、高压电泳法、凝胶层析法、高效液相色谱法及旋光测定法,此刻 使用最多的是HPLC法。凡是用两种以上方式判定的成果才能必定某一多糖的均 1)超离心法:微粒在离心力场中挪动的速度与其密度,大小和外形相关.将多糖样品溶于O.1mol/L氯化钠,或水,或O.1mol/L的Tris-HCl缓冲液中,浓 度为l~5%,进行密度梯度离心。待转速恒定后,间隔照明。若是获得的是单 一峰,则证明该多糖是均一组分。尝试室用此法须有阐发用带拍照设备的超速离 心计心情。 2)高压电泳:位阻要素决定了分歧多糖与硼砂构成分歧的复合物。所以在电场 感化下多糖的相对迁徙率常因复合物的分歧而分歧。常用玻璃纤维纸或丝绸布作 支撑物,缓冲液常用pH9.3-12的0.03.0.IM硼砂。电压强度约为30-50V/cm, 时问30-120分钟。用5%甲苯胺蓝显色,均一多糖呈单一色斑。 3)凝胶柱层析法:常用的凝胶为Sephadex、Sephacryl及Seppharoseo展层剂为 O.02-0.2mol/L氯化钠及0.04tool/L吡啶一0.02tool/L醋酸(1:1)等缓冲液。柱高 与柱直径比应大于40。 4)高效液相色谱法:德国等常用高压液相色谱来测定多糖的纯度,耐压合成凝 胶作为填料,成果靠得住. 5)旋光测定法:在多糖水溶液中插手乙醇,使其浓度为10%摆布,离心得沉淀。然后上清液中插手乙醇,使其浓度为20-25%,离心得第二次沉淀。若是两次沉 淀的比旋度不异,则申明该多糖为均一组分。 黄精多糖的提取工艺及其纯化、分手 1.3.5多糖的化学成分研究 1.3.5。1多糖的分子量测定 多糖的分子量只代表必然分子量范畴的平均分布。即便是统一多糖用分歧 的方式会测得分歧的分子量。例如商品化的尺度多糖DX-10(Pharmacia出品), 其量均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)别离为9.4x103和5.5x103。凡是文献报道 的多为量均分子量。过去常用的测定分子量的方式有:渗入法,超离心法、高压 电泳法、粘度法、跨越滤法、还原结尾法及聚合度法、光散射法等,这些方式比 较麻烦且误差很大。因为耐压合成凝胶的呈现,使得高效液相色谱法普遍使用于 多糖的纯度和分子量测定上。它具有快速、高分辩率和重现性好等长处。按照糖 的品种能够采用分歧的分手方式,如反相色谱、常规氨基烷柱液相色谱、高效离 子互换色谱、凝胶渗入色谱、多胺润色的硅胶色谱、毛细管色谱等。这些方式现 已获得普遍使用,如节制医用葡聚糖的质i[ImbetyAetal。1993]、直链与支链淀 粉的测定[BourneYetal,1993】,以及异麦芽低聚糖[Rademacher N,etal。1988]的组分分手等。尝试室中最简洁可用的是凝胶过滤法.将充实膨胀好 SephadexG-150或SephadexG-75湿法装柱用必然强度的氯化钠水溶液进行均衡, 然后将各类分歧的已知分子量的多糖尺度别离接踵上柱,统一离子强度的氯化纳 水溶液洗脱,分部收集,苯酚一硫酸法监测,别离求得洗脱体积ve,然后再将 兰葡聚糖(Mw>200万)上统一条柱,求出柱的空体积vo,按照ve/vo与lgM之间 具有着线性关系。可绘制尺度曲线。最初,将待测样品按上述不变的前提上柱, 求得待测多糖的ve。通过尺度曲线上的vc/vo,查得待测多糖的分子量对数, 便可求出M。每次缓冲液均需不异,不然会发生较大的误差。 13.5-2多糖的单糖组分的测定【张翼伸。1983】 常用的方式是用硫酸或盐酸I-3N,80.100"C,3-8小时封管将多糖完全水解。 水解后中和便是单糖的夹杂溶液,用纸色谱,薄层色谱、液相色谱或气相色谱进 行阐发. 1.4黄精多糖的研究 1.4.1生物活性研究黄精始载于‘明医别录》。为百合科黄精属(Liliaceae)多年生草本动物,有黄 精(Polygonatum sibiricum Red)、滇黄精(Polygonatumkingianmn Coll.etHe msl.)和 17 黄精多塘的提取工艺及其纯化、分手 多花黄精(Polygoaatam y!Etone姒H岫等。黄精属动物在全球分布很广,大约有40余种【现代合用本草IV,1997】,但顺应性较差、生境选择性强。‘中华人民共和 国药典2000》一部划定:以百合科动物黄精、多花黄精、滇黄精的干燥根茎入 药。按照外形来分,称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。以块大、肥润、色 黄白、断面通明者为优,昧苦者不成入药.李时珍【李时珍,1978】日:“黄精为服

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